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      細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)過(guò)程
      更新時(shí)間:2015-08-05   點(diǎn)擊次數(shù):746次

      細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)過(guò)程與細(xì)胞表面抗原檢測(cè)過(guò)程基本一致,只是在與一抗孵育前,需要預(yù)先對(duì)細(xì)胞用非離子去污劑進(jìn)行透化處理。

      操作方法

      1. 取已固定好的細(xì)胞爬片或甩片或經(jīng)過(guò)預(yù)處理的組織切片(石蠟或冰凍切片);

      2. 用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細(xì)胞2min(室溫),有些標(biāo)本可能需要長(zhǎng)達(dá)15min,時(shí)間視抗原而定;

      3. 余下步驟接上述“

      注意事項(xiàng)

      1. 在使用前,一抗二抗均應(yīng)測(cè)試其合適的稀釋度。

      2. 多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的,標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后,應(yīng)再用去污劑處理,如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),則會(huì)使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此,應(yīng)避免固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

      3. 信號(hào)微弱的解決方法:

      ① 提高一抗和二抗的濃度以增強(qiáng)敏感性 ,這必須測(cè)試各種濃度抗體的滴度;

      ② 延長(zhǎng)一抗和二抗的孵育時(shí)間。由于細(xì)胞染色時(shí)抗原吸附在固相載體上,抗原抗體結(jié)合時(shí)間較在溶液中長(zhǎng)。孵育時(shí)間可因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)作適當(dāng)調(diào)整,但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在以上兩點(diǎn)中,應(yīng)摸索出一個(gè)*條件以產(chǎn)生有效信號(hào)且保持良好的背景。這就需要反復(fù)試驗(yàn),因?yàn)槊拷M抗體和抗原的情況會(huì)有所不同;

      ③ 改變檢測(cè)方法,用共聚焦顯微鏡觀察,可提高敏感性。

       

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